水蛭素残留工程菌蛋白含量测定

时间:12-01-10　来源:论文代写网　作者:www.fldxw.com

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1材料与方法

1.1抗凝比活性测定

1.1.1试剂的配制0.5%纤维蛋白原：纤维蛋白原(上海莱士血制品有限公司)0.5g，以100ml生理盐水溶解。凝血酶：中国生物制品检定所制备的凝血酶，依照标示量，用生理盐水复溶后成100NIU/ml。阴性对照：以生理盐水为样品，凝血酶加入后立即凝固。标准对照：德国Hochest公司生产的Refludan，按照其标示活性溶解分装成1600ATU/支(即0.1mg/支)，冻干，具体操作步骤按说明书进行。

1.1.2方法凝血酶滴定法［1］(所有过程在37℃水浴中操作)。

1.1.3抗凝活性计算抗凝活性(ATU/ml)=(n-1)×100×稀释倍数，n为添加凝血酶的次数，1为扣除本底1次(即最后一次加入凝血酶，纤维蛋白原凝固)，100为凝血酶活性单位100NIU/ml，稀释倍数为所测定样品的稀释倍数。

1.1.4蛋白含量测定按改良Lowry法进行［6］。

1.1.5抗凝比活性抗凝比活性(ATU/mg)＝单位抗凝活性(ATU/ml)/单位蛋白含量(mg/ml)。

1.2抗血小板聚集比活性测定［7］

1.2.1试剂的配制ADP：Sigma公司，用生理盐水溶解并稀释，配成400μmol/L贮存液，-20℃保存。

1.2.2血小板来源正常志愿者。

1.2.3仪器血小板聚集仪(上海斯隆医电设备有限公司)。

1.2.4方法按说明书操作。

1.2.5结果判定血小板聚集抑制率：以未用药测得的血小板聚集率作为空白对照，体外给药后，测得的血小板聚集率除以空白对照所得的比值为相对聚集率，此相对聚集率与1的差值即血小板聚集抑制率。

血小板聚集抑制率＝1－(用药后测得的血小板聚集率/空白对照)

1.3纯度测定高效液相色谱法(HPLC)［6］。色谱主机：SHIMAZU，LC-10AD；色谱柱：DELTAPAKC18-300A，3.9mm×15cm；流动相：A：水+0.1%TFA；流动相：B：90%乙腈+0.1%TFA；梯度：100min内，流动相B从0%到100%；流速：0.2ml/min；样品浓度：1mg/ml；上样量：20μl；检测波长：280nm。

1.4肽图分析TPCK处理的胰蛋白酶酶解RGD-Hirudin样品和理化对照品，分别以C8柱反相层析柱，0.1%TFA-H2O/0.1%TFA-乙腈为流动相，214nm波长检测，并用质谱测定各肽段分子量，计算总分子量［6］。

1.5紫外光谱扫描在200～400nm波长范围内扫描RGD-Hirudin样品和理化对照品［6］。

1.6残留工程菌蛋白含量测定

1.6.1Pichia酵母全菌蛋白制备Pichia酵母在YPD培养基中30℃培养，菌体超声波/机械破碎，得蛋白初提物水溶液，Lowry法定量。

1.6.2抗Pichia酵母全菌蛋白多克隆抗体制备免疫动物：新西兰大白兔(2.5kg，雄性)；免疫蛋白：上述Pichia酵母全菌蛋白(20mg/只)，代写医学论文体积比1:1与完全福氏佐剂混合。免疫方法：背部皮下多点注射(1ml/点)，每周1次。多抗滴度：免疫4周后，取血，分离血清，双扩散法测定其效价，若高于1:16，即颈动脉放血，分离血清(抗酵母全菌蛋白多抗)；若低于1:16，则继续按上述方法免疫动物，直至效价高于1:16为止。

1.6.3残留工程菌蛋白含量测定(ELISA)Pichia酵母全菌蛋白系列浓度：100ng/ml、80ng/ml、60ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、0ng/ml。样品：1mg/ml。一抗：即自制抗Pichia酵母全菌蛋白多克隆抗体，稀释度为1:100。二抗：华美试剂公司，羊抗兔IgG-HRP，稀释度为1:1000。显色方法：邻苯二胺/H2O2/pH5柠檬酸缓冲液。比色方法：测定波长：492nm，参比波长：655nm。

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